Mikhaylova i dr. (2011) Vydkryttia spermatohenu u diploidnykh Pelophylax esculentus

Михайлова О. В., Кечеджи А. Є., Шабанов Д. А. Дослідження сперматогенезу у диплоїдних Pelophylax esculentus (Amphibia, Anura) за допомогою кариоаналізу в роздавлених препаратах // Праці Українського герпетологічного товариства. – 2011. – № 3. – С. 120-127.
УДК 597.851(576.354.4)
Дослідження сперматогенезу у диплоїдних Pelophylax esculentus (Amphibia, Anura) за допомогою кариоаналізу в роздавлених препаратах
О. В. Михайлова, А. Є. Кечеджи, Д. А. Шабанов
Харківський національний університет імені В. Н. Каразина,
пл. Свободи, 4, Харків, 61077 Україна
E-mail: d.a.shabanov@gmail.com
Дослідження сперматогенезу у диплоїдних Pelophylax esculentus (Amphibia, Anura) за допомогою кариоаналізу в роздавлених препаратах. Михайлова О. В., Кечеджи А. Є., Шабанов Д. А. – Представлені результати дослідження сперматогенезу 14 статевозрілих диплоїдних самців Pelophylax esculentus з Північно-Донецького центру різноманіття зелених жаб (Україна, Харківська обл.). Використано кариоаналіз у препаратах роздавлених мацерованих яєчок. Типовий хід сперматогенезу відповідає етапам гаметогенезу, описаним для P. esculentus із Західної Європи, причому у багатьох особин реєструється значна кількість анейуплоїдних клітин. У однієї диплоїдної особини в яєчках зафіксовано як диплоїдні клітини, з яких мають утворюватися гаплоїдні сперматозоїди, так і тетраплоїдні клітини, які мають дати диплоїдні сперматозоїди. У тієї ж особини в яєчках зафіксовано клітини з хромосомним набором, що значно перевищує тетраплоїдний.
Ключові слова: мейоз, Pelophylax esculentus, сперматогенез, геміклональне успадкування, диплоїдний і тетраплоїдний набор.
A Study of Spermatogenesis in Diploid Pelophylax esculentus (Amphibia, Anura) using Karyoanalysis in Squashed Preparations. Mykhailova O. V., Kechedzhi A. E., Shabanov D.A. – The results for gametogenesis of 14 mature diploid Pelophylax esculentus males from Seversko-Donetskiy center of diversity of green frogs (Ukraine, Kharkiv region) are shown. For the research caryoanalysis in squashed macerative testicles was used. Typical way of spermatogenesis is similar to the same in ovogenesis, which for P. esculentus from Western Europe were shown. Many individuals have a big amount of aneuploid cells. For the one of all examined diploid males in testicles, both diploid, giving the rise to haploid sperm, and tetraploid cells were registred. Cells with number of chromosomes largely exceeding tetraploid one were shown for the same individual.
Keywords: meiosis: Pelophylax esculentus, spermatogenesis, hemiclonal inheritance, diploid and tetraploid chromosome set.
Перше повідомлення про міжвидову гібридизацію у зелених жаб було опубліковано майже півстоліття тому (Berger, 1964). Протягом усього цього часу зелені жаби викликають постійний інтерес дослідників. Вже через 10 років після відкриття Л. Бергера Х. Тюннер показав, що існування гібридних зелених жаб підтримується завдяки гібридогенезу, клональному успадкуванню окремих геномів (Tunner, 1974). Використовуючи сучасну номенклатуру (Frost et al., 2006) і термінологію, можна сказати, що їстівна жаба, Pelophylax esculentus (Linnaeus, 1758), є геміклональним гібридом ставкової жаби, Pelophylax lessonae (Camerano, 1882) і озерної жаби, Pelophylax ridibundus (Pallas, 1771). І хоча їстівна жаба не є видом, але в силу ряду причин для неї використовується назва, аналогічна видовій. Різні представники гібридогенетичного комплексу зелених жаб здатні жити спільно, утворюючи системи, які запропоновано називати геміклональними популяційними системами, ГПС (Шабанов, Литвинчук, 2010). У ряді ГПС, крім диплоїдних гібридів, зустрічаються поліплоїдні (Plötner, 2005).
Існування ГПС зелених жаб підтримується специфічним характером гаметогенезу у гібридних особин. У диплоїдних гібридів у гамети переходить один з геномів, клональний; другий геном у типічному випадку елімінуються. Цитогенетичні дослідження механізмів цього успадкування розпочав Х. Тюннер, відкривач незвичного способу розмноження гібридних зелених жаб. У одній з публікацій, підсумовуючій роботу Х. Тюннера та його співавтора (Tunner, Heppich‑Tunner, 1991), підкреслюється, що тривале незалежне існування міжвидових гібридів можливе лише за допомогою аберантних (відносно типового статевого розмноження) механізмів розмноження. До їх числа належать партеногенез (розвиток зиготи з яйцеклітини без сперматозоїда), гіногенез (активація сперматозоїдом яйцеклітини без злиття ядер) і гібридогенез (злиття ядер з подальшою елімінацією одного з батьківських геномів).
Використовуючи флуоресцентну мікроскопію та електрофорез при вивченні гаметогенезу гібридних жаб із Західної Європи (переважно самок), Х. Тюннер і С. Хеппих‑Тюннер показали, що неклональний геном видаляється з клітин зароджувальної лінії ще до початку мейозу (Tunner, Heppich‑Tunner, 1991 та ін.). Дивовижний результат, отриманий цими австрійськими дослідниками, полягає в тому, що геміклональне успадкування підтримується завдяки двом різним аномаліям гаметогенезу. Видалення неклонального геному відбувається під час мітотичних поділів клітин зароджувальної лінії. Після цього клональний геном подвоюється, причому це подвоєння може відбуватися або під час мітотичних поділів оогоніїв, або вже під час мейозу, до стадії диплотени профази I.
У 2004 р. на території Східної України були описані ГПС зелених жаб, у яких суттєву частку гібридів становлять триплоїди жаб і зафіксовані одиничні тетраплоїдні гібриди (Borkin et al, 2004). Регіон їх поширення назвали Північно‑Донецьким центром різноманіття зелених жаб (Шабанов, Литвинчук, 2010). У цьому центрі відсутні статевозрілі P. lessonae, і всі геноми цього виду передаються у гібридів з покоління в покоління клонально. Серед диплоїдних самців зафіксовано такі, які виробляють гамети P. ridibundus, гамети P. lessonae і, нарешті, особини, які виробляють суміш гамети P. ridibundus і P. lessonae у співвідношенні, характерному для кожного індивідуума.
Сказане означає, що вивчення гаметогенезу самців гібридних жаб з Північно‑Донецького центру різноманіття представляє значний інтерес. Дана публікація відображає результати вивчення гаметогенезу диплоїдних гібридів. Для цього нами був використаний метод кариоаналізу по давленим препаратам В. В. Кліменка (Klymenko, 2001) з деякими змінами.
Матеріали і методи
У роботі вивчено яєчка 14 статевозрілих диплоїдних самців Pelophylax esculentus з Північно‑Донецького центру різноманіття, зловлених у 2010‑2011 рр. у околицях Біологічної станції Харківського національного університету імені В. Н. Каразина (с. Гайдари Зміївського р‑н Харківської обл.).
Попереднє визначення зелених жаб проводили за комплексом зовнішніх ознак (Шабанов і ін., 2006). Остаточне визначення базувалося на даних проточної ДНК‑цитометрії, яку виконували С. Н. Литвинчук і Ю. М. Розановий у ЦІН РАН (м. Санкт‑Петербург). Для кількох особин визначення плоїдності проводили на підставі вимірювання розмірів їх еритроцитів (Бондарева, Шабанов, 2011); у останніх випадках визначення переперевіряли за описаною нижче методикою в соматичних тканинах (тонкому кишечнику).
Ми використовували методику кариоаналізу в роздавлених препаратах за В. В. Кліменко (Klymenko, 2001) з деякими модифікаціями.
Зразки тканини яєчок поміщали не менше ніж на 2 сут у фіксатор з однієї об’ємної частини крижаного оцтового кислоти і трьох частин 96% етанолу, з протравою з оцтовокислого заліза (III). За потреби зразки зберігали у описаному фіксаторі.
Фрагмент тканини (близько чверті яєчка) переносили у 40% розчин гематоксиліну на крижаному оцтовому кислоті для забарвлення. Зразок витримували в барвнику протягом 1,5 год при t = 62‑64 °C. Часто під час забарвлення об’єкт розпадався на частини.
Після забарвлення ще дрібніший зразок тканини (на кінчику підготовчої голки) переносили на годинне скло в невелику кількість ацетохлоридгідрату (40% розчин хлоралгідрату в крижаному оцтовому кислоті). У цьому розчині відбувається вимивання надлишків фарби і набухання клітин. Протягом 5‑10 хв після початку промивання тканина стає світлішою і пухкою, що є необхідною умовою для приготування давленого препарату. На повне вимивання фарби до обесцвічування хромосом уходит близько 3 год, після чого хромосоми практично не видимі.
При візуальному контролі під бінокулярним мікроскопом, що знаходиться в краплі ацетохлоридгідрату, зразок тканини розрізали на найдрібніші фрагменти (по кілька сотень клітин), використовуючи мікрохірургічні інструменти (підготовчі голки, заточені на дрібнозернистому точильному камені). Отриманий фрагмент тканини поміщали в краплю ацетохлоридгідрату на предметне скло і накривали 1/4 або 1/16 частиною покривного скла. На покривне скло легенько натискали кінчиком підготовчої голки, добиваючись роздавлювання зразка до шару в одну клітину. Роздавлювання зразка проводили під мікроскопом при збільшенні 160 раз. На приготованому препараті вибирали клітини, що містять хромосоми на різних стадіях мітотичного або мейотичного поділу. Вибрані пластинки мікроскопували з збільшенням 160, 640 і 1600 раз з олійною іммерсією і фотографували за допомогою цифрової USB‑камери для мікроскопа.
Результати і обговорення
Типовий сперматогенез диплоїдних P. esculentus. При вивченні кариотипів з яєчок диплоїдних самців ми спостерігали хромосоми на різних стадіях, що відповідають течії гаметогенезу, описаному для гібридних жаб із Західної Європи.

Рис. 1. Мітотичне поділ диплоїдної клітини в яєчку P. esculentus. Стадія метафази з 26 хромосомами Fig. 1. Mitotic fission of the diploid cell in a P. esculentus testicle. Metaphase, showing 26 chromosomes

Сперматогонії проходять стадію росту і перетворюються в сперматоцити I порядку. До метафази I мейозу предки статевих клітин гибридів вже містять подвоєний набір хромосом (2n = 26), який несе дві копії одного з батьківських геномів.
Мейотичний поділ починається з профази, яку ділять на 5 стадій: лептотена, зиготена, пахитена, диплотена, діакінез. Профаза I мейозу характеризується тим, що на цій стадії відбувається кон'югація гомологічних хромосом і кросинговер, обмін ділянками між ними (Айала, Кайгер, 1987).
Для лептотени (стадії тонких ниток) характерний початок спіральності і ущільнення хромосом; вони набувають ниткоподібної форми. Зиготена ознаменована кон'югацією спочатку окремих ділянок гомологічних хромосом, яка завершується по всій їх довжині до кінця стадії. З’єднання гомологічних хромосом називається синапсисом. Для цієї стадії характерне появлення синаптонемного комплексу, що входить до складу біваленту — пари кон'югованих хромосом.
Стадія пахитени (стадія товстих ниток) характеризується гаплоїдною кількістю бівалентів, тобто фігур, утворених кон'югуючими хромосомами. Хромосоми утовщуються і укорочуються, і між ними відбувається кросинговер.
На стадії диплотени (стадія подвійних ниток) найчіткіше видна структура бівалентів. У гомологічних хромосом залишаються одна або кілька зон контакту, які називаються хіазмами. Помітна відносно велика спіральність хромосом у порівнянні зі стадією пахитени.
Діакінез характеризується максимальним утовщенням і спіральністю хромосом. Хіазми переміщуються в напрямку від центромери до кінців хромосом і зникають (рис. 2); цей процес називається терміналізацією хіазм (Айала, Кайгер, 1987).

Рис. 2. Мейоз у яєчку P. esculentus. Стадія профази I: діакінез. Видно 13 кільцевих структур: гомологічних хромосом, з’єднаних попарно кінцевими ділянками на стадії терміналізації хіазм Fig. 2. Meiosis in a P. esculentus testicle. Late prophase – diakinesis, showing the terminalization of 13 ring-shaped pairs of homologous chromosomes, connected with their ends

У вивчених нами гибридів зелених жаб добре помітні прояви кросинговеру: хіазми на стадії диплотени, терміналізація хіазм під час діакінезу. Важливо підкреслити, що оскільки кросинговер відбувається між копіями одного батьківського геному, він не повинен призводити до генетичної рекомбінації.
Протягом профази I точний підрахунок кількості хромосом можливий лише на стадії діакінезу, і дуже рідко — пахитени.
Після профази I слідує стадія метафази I мейозу, на якій гомологи максимально зближені і утворюють 13 бівалентів. Потім в анафазі біваленти розпадаються, і гомологічні хромосоми розходяться до полюсів. Навколо кожного набору гомологів утворюється ядерна мембрана, і клітина ділиться на дві дочірні. Це стадія телофази I. У результаті утворюються дві ідентичні гаплоїдні клітини — сперматоцити II порядку, які, минаючи стадію інтерфази, одразу вступають у друге поділ мейозу.
Профаза II мейозу дуже коротка, і клітини на цій стадії зустрічаються надзвичайно рідко. У метафазі II клітина містить гаплоїдний набір, який у зелених жаб у нормі становить 13 хромосом. Зазвичай дві такі клітини, що утворилися після редукційного поділу, лежать поруч (рис. 3).

Рис. 3. Мейоз у яєчку P. esculentus. Стадія метафази II. Видно 2 пластинки по 13 хромосом у кожній (1n) Fig. 3. Meiosis in a P. esculentus testicle. The second metaphase of meiosis. Two plates with 13 chromosomes in each are shown

В анафазі II центромера кожної хромосоми ділиться, і вона розпадається на дві хроматиди (дочірні хромосоми), які розходяться до полюсів клітини. У результаті в ранній телофазі видно «пучки» по 13 дочірніх хромосом. Отримані гаплоїдні клітини називаються сперматидами. Далі вони диференціюються в спермії.
Таким чином, в результаті мейотичного поділу диплоїдної клітини у самців утворюються 4 гаплоїдні гамети. У випадку геміклонального розмноження P. esculentus всі гамети однієї особини несуть ідентичний клональний геном.
Аномалії сперматогенезу. Вище описано типовий хід сперматогенезу, від якого в ряді випадків вдається спостерігати різноманітні відхилення. У яєчках гібридних зелених жаб реєструється значна кількість анеуплоїдних клітин, тобто клітин, що мають кількість хромосом, не кратну гаплоїдному набору. Такі аномалії свідчать про нестабільність процесів утворення статевих клітин у гібридних формах зелених жаб.
Особливий інтерес представляє хід мейозу в яєчках у одного з самців P. esculentus, спійманого навесні 2011 р. в околицях с. Гайдари. Ця особина була діагностована як диплоїдна на підставі розміру її еритроцитів. У тонкому кишечнику у цієї жаби ми спостерігали виключно диплоїдні клітини. У яєчках у цього самця, поряд із типовими мітотичними метафазами з диплоїдним набором хромосом, знайдено клітини, у яких кількість хромосом перевищує подвоєний набір. Зокрема нами були зафіксовані тетраплоїдні метафазні пластинки (рис. 4).

Рис. 4. Мітоз у яєчках P. esculentus. Метафаза. Тетраплоїдний набір хромосом (4n) Fig. 4. Meiosis in a P. esculentus testicle. Metaphase I, showing a tetraploid chromosome set (4n)

Тетраплоїдні хромосомні набори зафіксовані також на стадіях пахитени та метафази I мейозу (рис. 5). Поява тетраплоїдних клітин у зароджувальній лінії диплоїдних P. esculentus може бути пояснена кількома способами. Можна припустити, що елімінація не відбулася і обидва батьківські геноми подвоїлися, або ж після видалення неклонального геному подвоєння клонального відбулося двічі.

Рис. 5. Мейоз у яєчках P. esculentus. Пізня метафаза I. Видно подвоєний набір бівалентів (4n). Гомологічні хромосоми добре розрізняються і обособлені, але ще з’єднані попарно перед самим розходженням Fig. 5. Meiosis in a P. esculentus testicle. Late metaphase I, showing diploid number of bivalents (4n). Homologous chromosomes are detached and well observable, but still connected in pairs