Студенческие работы после практики II курса - 2017

Горенский Г. Г., Андреев Д. А., Онищенко К. С., Пустовалова Э. С. Исследование структуры популяционной системы зеленых лягушек (Pelophylax esculentus complex) Иськового пруда Змиевского района Харьковской области // «Біологія: від молекули до біосфери». Матеріали XІI Міжнародної конференції молодих учених (26 листопада - 1 грудня 2017 р., м. Харків, Україна). – Х.: ФОП Шаповалова Т. М., 2017. – С. 132-133.

Лукан Р. М., Пустовалова Е. С., Бірюк О. В. Метод прижиттєвого визначення плоїдності пуголовків зелених жаб // «Біологія: від молекули до біосфери». Матеріали XІI Міжнародної конференції молодих учених (26 листопада - 1 грудня 2017 р., м. Харків, Україна). – Х.: ФОП Шаповалова Т. М., 2017. – С. 141-142.

Фомичева А. Ю., Лобойко Д. И. Изучение состава гемиклональной популяционной системы зеленых лягушек Корякова яра (Змиевской район Харьковской области) // «Біологія: від молекули до біосфери». Матеріали XІI Міжнародної конференції молодих учених (26 листопада - 1 грудня 2017 р., м. Харків, Україна). – Х.: ФОП Шаповалова Т. М., 2017. – С. 149-150.

Fomenko K. S., Trokhymchuk R. R., Lukan R. M., Makaryan R. N., Pustovalova E. S. The study of hemiclonal population system Pelophylax esculentus complex from the Lower Dobritskiy pond (the territory of the National Park “Gomolshanski lisy”) // «Біологія: від молекули до біосфери». Матеріали XІI Міжнародної конференції молодих учених (26 листопада - 1 грудня 2017 р., м. Харків, Україна). – Х.: ФОП Шаповалова Т. М., 2017. – С. 152-153.

Stepanenko K. R. Hemiclonal population systems features’ influence on spermatozoid size in Pelophylax esculentus complex // «Біологія: від молекули до біосфери». Матеріали XІI Міжнародної конференції молодих учених (26 листопада - 1 грудня 2017 р., м. Харків, Україна). – Х.: ФОП Шаповалова Т. М., 2017. – С. 153.

 

Исследование структуры популяционной системы зеленых лягушек (Pelophylax esculentus complex) Иськового пруда Змиевского района Харьковской области

Горенский Г. Г., Андреев Д. А., Онищенко К. С., Пустовалова Э. С.

Харьковский национальный университет имени В. Н. Каразина, биологический факультет, пл. Свободы, 4, г. Харьков, Украина, 61022

е-mail: gorenskiyg@outlook.com

Группа зеленых лягушек, Pelophylax esculentus complex, которая состоит из двух родительских видов: P. lessonae (Camerano, 1882) и P. ridibundus (Pallas, 1771), а также их естественных гибридов P. esculentus (Linnaeus, 1758), образует гемиклональные популяционные системы, ГПС (Шабанов та ін., 2009). Мы изучали ГПС зеленых лягушек Иськова пруда (окрестности с. Гайдары Змиевского района Харьковской области). Наблюдения за данной ГПС ведутся с 1995 года, когда на пруду была обнаружена крупная популяция P. esculentus, состоящая из диплоидных особей с эффективным воспроизводством (Лада, 1996). Состав ГПС за время изучения изменялся. В 2000 году ГПС перешла в критическое состояние в результате осушения пруда; в 2005 году, во время нереста, на пруду наблюдались только самцы; в 2011 году отмечено успешное воспроизводство данной ГПС. В связи с этим, исследование ее структуры представляет значительный интерес. Цель нашего исследования – изучение полового и видового состава ГПС Иськова пруда для дальнейшего мониторинга ее состояния. Видовую и половую принадлежность определяли по комплексу внешних признаков (Шабанов, 2015). Плоидность особей определяли путем измерения средней длины эритроцитов на микрофотографиях мазков крови (Бондарева и др., 2012) с использованием программы PDF-XChangeViewer. Статистическую обработку полученных данных проводили при помощи программы Statistica 8.0. Всего изучили 137 особей. Доля самцов в выборке составила 95,6 %; самок – 2,9 %; неполовозрелых особей – 1,5 %.

По литературным данным, типичные размеры эритроцитов диплоидов варьируют от 21 до 26 мкм, а для триплоидов характерны эритроциты крупнее 26 мкм (Бондарева и др., 2012). В изученной нами выборке доля диплоидных особей P. esculentus составила 94,2 % (129 особей), триплоидных – 1,5 % (2 особи), к виду P. ridibundus относились 4,4 %. Средний размер эритроцитов у диплоидов составил – 23,3 мкм, а у триплоидов – 29,6 мкм. По сравнению с данными 2015 г. (Черепашук и др., 2015), значимое изменение доли триплоидов не зарегистрировано (p = 0,35).

Зависимость между полом и размером эритроцитов установлена не была. Таким образом было подтверждено, что в Иськовом пруду обитает популяционная система R-E-Ep-типа, близкая к чистому E-типу, со значительным преобладанием диплоидных гибридов.

Summary. Group of water frogs in hemiclonal population system from Iskov pond was studied. We tried to find out the difference in size of erythrocyte between diploids and triploids of Pelophylax esculentus complex. The method we used to spot the ploidy was measuring the average length of red blood cells. The total number of individuals was 87; the percentage of triploids was 1.5 %. The average size of diploid erythrocytes was 23.3 μm and triploid red blood cells were estimated at 29,6 μm. Thus, we confirmed, that population system of Iskov pound belongs to R-Е-Еp-type.

Авторы благодарят профессора кафедры зоологии и экологии животных ХНУ, д. б. н. Шабанова Д. А. за идею и научное руководство, а также всех участников отлова.

 

Метод прижиттєвого визначення плоїдності пуголовків зелених жаб

Лукан Р. М., Пустовалова Е. С., Бірюк О. В.

Харківський національний університет імені В. Н. Каразіна, біологічний факультет, кафедра зоології та екології тварин, пл. Свободи, 4, м. Харків, Україна, 61022

e-mail: minihobbit29@gmail.com

Геміклональне спадкування – незвичайний рідкісний спосіб відтворення серед хребетних тварин, з яким пов’язаний цікавий напрямок досліджень. Такий спосіб спадкування пришвидшує еволюцію (Шабанов, Литвинчук, 2010), його вивчення може в майбутньому дати початок новим методам у селекції, біотехнології тварин та генній медицині. Складні геміклональні популяційні системи (ГПС) гібридогенного комплексу зелених жаб (Pelophylax esculentus complex), наприклад такі, що населяють водойми Харківської області, є об’єктами моніторингу їх складу (Meleshko et al., 2014). У складі цих ГПС зареєстровано диплоїдні та триплоїдні міжвидові гібриди P. esculentus (Linnaeus, 1758) обох статей, а також особини батьківського виду P. ridibundus (Pallas, 1771) (Шабанов, 2015). Ще досі достеменно не відомо, яким чином регулюється склад ГПС. Існує припущення, що важливу роль у регуляції їх складу грає вибіркова смертність певних форм (Бірюк та ін., 2016).

Розробка методу прижиттєвого визначення плоїдності пуголовків є актуальною задачею, з огляду на те що у них, на відміну від дорослих особин, неможливо визначити плоїдність за мазками крові (Бондарева та ін., 2012). Такий метод розширив би можливості вивчення геміклонального спадкування у зелених жаб, уможливлюючи дорощування пуголовків для подальшого їх вивчення і оцінки вибіркової смертності серед пуголовків різної плоїдності.

Метод прижиттєвого визначення плоїдності пуголовків, представлений у даній роботі, полягає у прижиттєвому вилученні зразків тканин шляхом ампутації частини хвостового плавця після визначення стадії розвитку (Gösner, 1960) і розміру пуголовків (McDiarmid and Altig, 1999). Для цього нами було зібрано вибірку з 15 пуголовків роду Pelophylax з Нижнього Добрицького ставу (Зміївський р-н, Харківська обл.). На даному матеріалі ми перевірили можливість інкубування ампутованого фрагменту тканини в розчині колхіцину, як засобу отримання достатньої для каріоаналізу кількості метафазних пластинок. Попередні дослідження показали, що необхідно виготовити ізотонічний розчин колхіцину (Шерстюк и др., 2016). Ми спробували декілька варіантів його розбавлення: у дистильованій воді, гіпотонічному розчині та розчині Версена. Далі зразки витримували 20 хвилин у чистому гіпотонічному розчині 0,07 M KCl, а після цього занурювали у фіксатор Карнуа. Розкапування суспензії клітин і фарбування реактивом Романовського-Гімзи проводили за раніше описаною методикою (Вегерина и др., 2013). Найкращими виявилися препарати від зразків, які витримувалися у розчинах, виготовлених на основі 0,07 M KCl – спостерігалася велика кількість нормальних клітин та поодинокі метафазні пластинки. Можливо, це пов’язано з низькою проліферативною активністю тканин хвоста у пуголовків на пізніх стадіях розвитку (вивчали пуголовків на стадіях 26–37 за Госнером, 1960). Рекомендується робити по декілька скелець із розкапаними клітинами. Серед 15 розглянутих пуголовків усі виявилися диплоїдними. Згодом, їх плоїдність була підтверджена за кількістю ядерець методом Ag-фарбування (Бирюк и др., 2015).

Таким чином, ми з’ясували, що для зажиттєвого визначення плоїдності пуголовків зелених жаб можна використовувати тканини хвостового плавця. Для цього необхідно інкубувати їх у 0,2 % розчині колхіцину у 0,07 M KCl протягом 4–5 годин з подальшим зануренням у гіпотонічний розчин (0,07 M KCl) на 20 хвилин. Після фіксації такі тканини готові для отримання хромосомних препаратів.

Summary. The study was performed to determine the proportion of triploids among tadpoles of Pelophylax genus and to improve an intravital method of ploidy determination. 15 tadpoles from the population of Pelophylax esculentus complex inhabited the Lower Dobritsky pond (Zmiyiv district of the Kharkiv region, the floodplain of the Gomolsha River at the National Natural Park "Gomilshanski lisy") were studied. No triploids have been found.

Автори висловлюють подяку д. б. н., професору кафедри зоології та екології тварин Д. А. Шабанову за ідею, наукове керівництво та всебічну підтримку при опрацюванні результатів.

 

Изучение состава гемиклональной популяционной системы зеленых лягушек Корякова яра (Змиевской район Харьковской области)

Фомичева А. Ю., Лобойко Д. И.

Харьковский национальный университет имени В. Н. Каразина, биологический факультет, кафедра зоологии и экологии животных, пл. Свободы, 4, г. Харьков, Украина, 61022

e-mail: anastasiafomichova1904@gmail.com

Два родительских вида зеленых лягушек Pelophylax ridibundus (Pallas, 1771) и Pelophylax lessonae (Camerano, 1882) при скрещивании между собой дают гибрид – Pelophylax esculentus (Linnaeus, 1758). Такие гибриды способны к гемиклональному наследованию: передаче родительских геномов из поколения в поколение клонально, т. е. без рекомбинации. Совместное воспроизведение P. esculentus и, как правило, представителей родительских видов, приводит к формированию гемиклональных популяционных систем (ГПС), в которых передаются как клональные, так и рекомбинантные геномы.

ГПС зеленых лягушек, населяющих Коряков яр (окрестности биостанции ХНУ имени В. Н. Каразина, с. Гайдары, Змиевской район, Харьковская область), изучается более 20 лет. В 1995-1996 гг. здесь была выявлена популяционная система, состоящая только из диплоидных P. esculentus (Лада, 1998). В 2000-х гг. в Коряковом яру лягушек почти не было. В 2015 г., по неопубликованным данным (Ю. Артемова, Т. Бешенцева, Е. Мелешко), было зарегистрировано 83 особи.

Цель данной работы − изучение состава ГПС зеленых лягушек Корякова яра в 2017 году и сравнение полученных данных с результатами исследования в 2016 году.

Животных отлавливали руками в темное время суток с использованием фонаря. Видовую и половую принадлежность определяли по комплексу морфологических признаков (Шабанов, 2015). Длину тела измеряли штангенциркулем. Лягушек метили отрезанием длиннейшего пальца на задней правой конечности и обрабатывали препараты мазков крови по общепринятой методике (Бондарева и др., 2012). Лягушек с эритроцитами длиной более 28 мкм диагностировали как триплоидов. Мы исследовали 230 особей, среди которых оказалось 3 ♀♀ и 5 ♂♂ P. ridibundus, 10 ♀ ♀ и 136 ♂♂ P. еsculentus (2n), 1 ♀ P. еsculentus (3n) и 9 ♂♂ P. еsculentus (3n), а также 66 ювенильных особей. Доля триплоидных особей составила 6 % от всей выборки. Разница в составе выборок 2017 и 2016 гг. оказалась статистически незначима (р = 0,53). В выборке 2017 г. метки 2016 г. найдены не были.

Таким образом, Коряков яр населяет R-E-Ep-HPS (т. е. ГПС, включающая P. ridibundus, а также ди-и триплоидов P. esculentus) со значительным преобладанием диплоидных самцов P. esculentus и невысокой долей триплоидов (6 %). В сравнении с 2016 годом (Стах В. О. та ін., 2016) ГПС зеленых лягушек Корякова яра существенно не изменилась.

Summary. The water frogs, living in Koryakov ravine (near the village Gaydary in Zmievsky district of the Kharkov region), form hemiclonal population systems. Diploid males of P. esculentus are prevailing. The share of triploids is 6 %. In comparison with the 2016 HPS Pelophylax esculentus complex structure has not changed significantly (p = 0.53).

Научный руководитель: д. б. н., проф. кафедры зоологии и экологии животных Шабанов Д. А.

 

The study of hemiclonal population system Pelophylax esculentus complex from the Lower Dobritskiy pond (the territory of the National Park “Gomolshanski lisy”)

Fomenko K. S., Trokhymchuk R. R., Lukan R. R., Makaryan R. N., Pustovalova E. S.

V. N. Karazin Kharkiv National University, department of zoology and ecology of animals, Freedom square, 4, Kharkiv, Ukraine, 61022

e-mail: rtrokhymchuk@gmail.com

Hybridogenic complex of water frogs consists of pool frog Pelophylax lessonae Camerano, 1882, marsh frog Pelophylax ridibundus Pallas, 1771, and edible frog Pelophylax esculentus Linnaeus, 1758. Hybrids and parent species reproduced jointly, forming hemiclonal population systems (HPS). We studied HPS of the Lower Dobritskiy pond (the region of the floodplain near the Gomolsha river, the territory of the National Park “Gomolshanski lisy”). It is prosperous HPS with the high proportion (about 30 %) of triploids among adult frogs (Meleshko et al., 2014). So, the selection of frogs, collected in 2016, consisted of 36 diploids (P. esculentus and P. ridibundus) and 14 triploids P. esculentus.

The purpose of this work is determination of correlation of di- and triploids among the tadpoles of water frogs in HPS of the Lower Dobritskiy pond. We studied a random selection of 27 tadpoles, collected in 29.06.2017. Ploidy was determined by the method of carioanalysis of intestine cells. (Бирюк и др., 2016). All studied tadpoles were diploids.

This result is consistent with the data of R. R. Lukan and coauthors (see work in this digest) that studied 15 tadpoles from the same selection by the method of vital ploidy determination. On the whole in the incorporated selection from 42 tadpoles all of them were diploids. The triploid tadpoles proportion meaningfully (p = 0.0003) differs from the proportion of triploid frogs.

We suppose that stability of HPS of the Lower Dobritskiy pond is determined by death of majority of diploid tadpoles. For example, if triploid is only a 1 tadpole from 50, but 47 diploid tadpoles from 49 will die, it is possible not to find triploids among the tadpoles, and among frogs proportions of di- and triploids will be 2:1. Partly it can be related to death of individuals of parent species that were broods from hybrids that transmitting a specific clonal genome. Alternative explanations of the registered phenomenon are the dramatic change of composition of studied HPS or the space segregation of di- and triploid tadpoles. These assumptions are not confirmed by the present results of the field researches.

Scientific supervisor: prof. D. A. Shabanov. The authors thank O. V. Biriuk and students of V. N. Karazin Kharkiv National University.

 

Hemiclonal population systems features’ influence on spermatozoid size in Pelophylax esculentus complex

Stepanenko K. R.

V. N. Karazin Kharkiv National University, University, Department of zoology and animal ecology, Svobody Sq., 4, Kharkiv, 61022, Ukraine

e-mail: stepanenko.k.r@gmail.com

Pelophylax esculentus complex forms hemiclonal population systems (HPS) of two parental species, Pelophylax ridibundus (Pallas, 1771) and Pelophylax lessonae (Camerano, 1882) with their hybrid, Pelophylax esculentus (Linnaeus, 1758). Hemiclonality is inheritance of non-recombinant genomes (genomes R from P. ridibindus and L genomes from P. lessonae) that is typical for P. esculentus. In some populations of water frogs triploid individuals amount a stable part. These reasons cause anomalies in water frogs’ spermatogenesis such as meiosis violations, partial and complete sterility (Biriuk et al., 2016).

We attempted to define factors, which influence on spermatozoid size. Samples of urinal sperm were extracted according to earlier described technique (Степаненко та ін., 2017). Then we measured spermatozoids’ heads to build size distributions. We have compared P. ridibundus, P. lessonae, di- and triploid P. esculentus out of different types of hemiclonal systems from Volyn’ and Harkiv regions of Ukraine.

Different HPS might consist of parental species (P. ridibundus (R-), P. lessonae (L-)), diploid (E-) and triploid (Ep-) hybrids. Males from R-E-, R-E-Ep and L-E-R hemiclonal population systems were examined in this research. To analyze comparison groups, we estimated distances between distributions.

Assumption was made that size of spermatozoids are above all determined by quantity of DNA. Therefore, aneuploid and diploid sperms have to look as an additional spike on a distribution. Nevertheless, additional spikes turned out to be inexpressive, so we had no sufficient grounds to confirm or deny presence of diploid spermatozoids.

Since Kruskal-Wallis and median test has shown significant (p < 0,05) difference between some of the comparison groups we considered that there is a complicated relation, which link spermatozoid size and waterfrogs’ species, ploidy and type of hemiclonal system.

The largest distinctions of spermatozoid size distributions were shown between P. esculentus from different regions of Ukraine unlike to P. ridibundus from same localities, which distributions are similar. Distribution of P. ridibundus and P. lessonae from L-E-R HPS turned out to be the most uniform. That points at high reproductive stability of L-E-R system.

On the basis of foregoing, we suppose that features of HPS (presence of diploid or especially triploid hybrids, both of the parental species etc.) leave mark on individuals’ reproduction and stability of their gametogenesis. Ploidy and geographical factor also influence on size of spermatozoids.