Bonderova i dr. (2012) Цитогенетичні особливості еритроцитів зелених жаб

Цитогенетичні особливості еритроцитів зелених жаб з Сіверсько-Донецького центру різноманіття Pelophylax esculentus complex
A.A.Bondarieva, Yu.S.Bibik, S.M.Samilo, D.A.Shabanov
Розглядається вплив триплоїдності на морфологічні параметри еритроцитів у Pelophylax esculentus, геміклональних гібридів зелених жаб. Показано, що триплоїдність призводить до збільшення розмірів еритроцитів, ядерно-цитоплазматичне відношення залишається постійним, відносна поверхня клітини зменшується. Еритроцити триплоїдів характеризуються більш еліптичною формою, ніж еритроцити диплоїдів. В залежності від розмірів еритроцитів досліджені представники Pelophylax esculentus поділені на три групи: особини з аномально дрібними еритроцитами, типові диплоїди та триплоїди. Визначено кількість гранул гетехроматину у ядрах еритроцитів жаб, що відносяться до цих трьох груп. Вірогідно, у особин з аномально дрібними еритроцитами ядра клітин містять відносно більшу кількість гетерохроматину.
Ключові слова: Pelophylax esculentus (= Rana esculenta), еритроцити, триплоїди, диплоїди, гетерохроматин.
Erythrocytes cytogenetic characteristics of green frogs from Siversky Donets centre of Pelophylax esculentus complex diversity
A.A.Bondarieva, Yu.S.Bibik, S.M.Samilo, D.A.Shabanov
The influence of triploidy on erythrocyte morphological parameters of Pelophylax esculentus, hemiclonal hybrids of green frogs, is considered. It is shown that triploidy leads to enlarging of erythrocytes while nuclear-cytoplasmic ratio remains constant and relative cell surface decreases. Triploid erythrocytes are characterized by more ellipsoid shape in comparison with diploid cells. Due to erythrocyte size investigated Pelophylax esculentus were divided into three groups: individuals with abnormally small erythrocytes, typical diploids and triploids. The heterochromatin granules quantity in frogs erythrocyte nuclei was estimated. It is supposed that erythrocyte nuclei of individuals with abnormally small cells contain relatively more heterochromatin.
Key words: Pelophylax esculentus (= Rana esculenta), erythrocytes, triploids, diploids, heterochromatin.
Вступ
У склад гибридного комплексу зелених жаб (Pelophylax esculentus complex) входять два батьківські види: ставкові жаби, Pelophylax lessonae (Camerano, 1882) і озерні жаби Pelophylax ridibundus (Pallas, 1771), а також їх гібриди (отримали назву, аналогічну видовій): їстівні жаби, Pelophylax esculentus (Linnaeus, 1758). Pelophylax esculentus демонструють незвичні способи розмноження, що використовують, зокрема, геміклональне успадкування – клональну передачу в гамети одного з батьківських геномів. У Сіверсько-Донецькому центрі різноманіття зелених жаб (Shabanov, Litvinchuk, 2010) широко поширені як диплоїдні, так і триплоїдні P. esculentus. Серед них є і особини, які мають два геноми P. ridibundus і один – P. lessonae, і особини з двома геномами P. lessonae і одним P. ridibundus.
Диплоїдні та триплоїдні P. esculentus живуть в одних місцевих середовищах, розмножуються в спільних нерестових групах, мають схожі розміри, суттєво не відрізняються за тривалістю життя і не мають виразних зовнішніх чи поведінкових особливостей (Plotner, 2005; Shabanov, Litvinchuk, 2010; Usova, 2010). Це робить їх чудовим об’єктом для вивчення впливу плоїдності клітин на різноманітні цитологічні параметри.
Сучасна батрахологія знає ряд груп амфібій, до складу яких входять близькородинні ди-, три- і тетраплоїдні види, як це, наприклад, спостерігається в групі зелених жаб, Bufo viridis complex (Litvinchuk et al., 2011). Однак у випадку таких груп особини з різною плоїдністю належать до різних видів, що відрізняються особливостями своїх місць існування і пройшли більш-менш незалежну еволюцію. Геноми триплоїдних зелених жаб еволюціонували в триплоїдних організмах, а геноми триплоїдних зелених жаб отримані ними від диплоїдних батьківських видів. Можна очікувати, що цитологічні ефекти, викликані триплоїдністю, будуть проявлятися у P. esculentus більш явно, не будучи компенсованими дією природного відбору. Спостережувані властивості організмів, у тому числі характеристики їх клітин, є результатом компромісу між потребами оптимізації різних параметрів (Bigon et al., 1989; Rasnitsyn, 2002). У триплоїдних жаб геноми, що є результатом еволюції диплоїдних організмів, опиняються в триплоїдних ядрах. Цікавим завданням для дослідження є з’ясування того, як це вплине на ядерно-цитоплазматичне відношення, відносну поверхню клітин, їх кількість в окремих органах і в організмі в цілому, інші параметри клітин і організмів.
Ди- і триплоїди P. esculentus практично не відрізняються на біохімічному рівні, оскільки розвиваються під керуванням однакових геномів, отриманих від батьківських видів. Вони дуже схожі і на організменному рівні (Plotner, 2005; Usova, 2010). Однак вони різко відрізняються на клітинному рівні, що є наслідком різної кількості батьківських геномів, що припадає на кожну клітину. Це пов’язано, перш за все, з тим, що для збереження постійності ядерно-цитоплазматичного відношення у триплоїдів, ядро яких у 1,5 рази більше порівняно з диплоїдами, після ядра має збільшуватись і вміст цитоплазми, а отже, і розмір клітини (Plotner, 2005; Shabanov, Litvinchuk, 2010).
Для диплоїдних і триплоїдних жаб зафіксовано значне різницю в розмірах еритроцитів, і це використовують як один із способів визначення плоїдності жаб (George, Lennartz, 1980; Polls Pelaz, Graf, 1988; Plotner, 2005). Детальне вивчення впливу плоїдності жаб на інші гематологічні показники не проводилось, тоді як для деяких видів риб показано, що триплоїдність у різній мірі впливає на різні морфологічні параметри еритроцитів. Так, велика вісь клітини у вивчених риб збільшується в більшій мірі порівняно з малою віссю (Cal et al., 2005). При збільшенні розмірів клітин слід очікувати зменшення їх відносної поверхні (об’єм клітин зростає пропорційно третій степені лінійних розмірів, а площа поверхні – повільніше, пропорційно другій степені). Це означає, що транспорт речовин через поверхню еритроцитів у триплоїдних особин може бути ускладнений. Як це обставина вплине на газообмін, невідомо.
У нашій роботі проведено порівняння еритроцитів ди- і триплоїдних гібридів зелених жаб (Pelophylax esculentus). Першим рівнем порівняння еритроцитів стало вивчення їх розмірів і морфології, а другим – порівняння ступеня конденсації ядерного матеріалу.
Матеріали і методи
Ми досліджували вибірку жаб, зібраних у басейні р. Сіверський Донец у Зміївському районі Харківської області 18 вересня 2010 року. Вибірка з 58 особин, визначених за зовнішніми ознаками (Shabanov et al., 2006) як P. esculentus (довжина тіла 6,91±0,62 см), була представлена переважно самцями (54 особини).
Для кожної особини робили мазок крові за стандартною методикою, який без фарбування фотографували під великим збільшенням мікроскопа (?40) за допомогою USB‑камери. Під тим же збільшенням фотографували об’єкт‑мікрометр. За допомогою програми PDF‑XChange Viewer по фотографіям мазків для 10 клітин на кожен мазок вимірювали велику і малу вісь еритроцита, а також велику і малу вісь його ядра; потім ці вимірювання переводили в мікрометри. Площу перерізу клітини (видиму на препараті) розраховували за формулою , площу поверхні клітини – як площу поверхні еліпса обертання , об’єм за формулою , де a і b – велика і мала піввісі еритроцита відповідно. Аналогічно обчислювали площу перерізу, площу поверхні і об’єм ядра. На підставі отриманих даних підрахували ядерно-цитоплазматичне відношення.
Для 14 особин з даної вибірки плоїдність, а також приналежність до Pelophylax esculentus, була точно встановлена С. Н. Литвинчуком і Ю. М. Розановим (Цитологічний інститут РАН, м. Санкт‑Петербург) в результаті вимірювання кількості ДНК, що припадає на клітину, за допомогою проточної ДНК‑цитометрії (метод охарактеризований, наприклад, у Litvinchuk et al., 2011).
Для порівняння ступеня конденсації гетерохроматину в еритроцитах готові препарати мазків крові фарбували за методом Фельгена (фарбування реактивом Шіффа з попереднім холодним гідролізом 5N HCl протягом 20 хв) (Roskina, Levinson, 1957). Кількість гранул гетерохроматину підраховували під великим збільшенням мікроскопа (?640). Всього було проаналізовано 11 мазків крові (по 50 клітин на мазок), з них 6 диплоїдних, 3 триплоїдних і 2 – особин з аномально дрібними еритроцитами (див. далі).
Для визначення ступеня деконденсації гетерохроматину в ядрах еритроцитів використовували різний час кислотного гідролізу. Для даного дослідження дві частини одного мазка еритроцитів певної особини піддавали фарбуванню за методом Фельгена з різним часом експозиції в соляній кислоті (20 хв і 60 хв). Оптичну густину ядер і цитоплазми еритроцитів визначали за фотографіями фарбованих мазків за допомогою програми Adobe Photoshop. Досліджували ступінь деконденсації хроматину ядер еритроцитів 10 особин жаб: 5 диплоїдів і 5 триплоїдів. Відношення оптичної густини ядра до оптичної густини цитоплазми розраховували за формулою , де f – оптична густина фону; c – оптична густина цитоплазми; n – оптична густина ядра.
Значимість відмінностей параметрів еритроцитів ди- і триплоїдів P. esculentus (а також диплоїдів і особин з аномально дрібними еритроцитами) оцінювали за допомогою непараметричного критерію Манна‑Уїтні.
Результати і обговорення
За середньою площею перерізу еритроцитів для кожної особини були виділені три групи жаб (рис. 1). 43 особини групи ІІ мали типові для диплоїдів еритроцити, довжиною 21–26 мкм, 12 особин групи ІІІ мали великі еритроцити (більше 26 мкм), характерні для триплоїдів. При цьому у групі триплоїдів виділяються дві підгрупи: особини з еритроцитами до 39 мкм у довжину і особини, еритроцити яких більше 40 мкм. Три особини з групи І мали аномально дрібні, розміром менше 20 мкм, еритроцити (табл. 1).
З досліджених за допомогою проточної ДНК‑цитометрії особин усі 12 представників групи ІІ (включаючи особини з найбільшими еритроцитами в групі, довжиною 26,1 мкм, і з одними з найдрібніших, 22,6 мкм), виявилися диплоїдами. З групи І була досліджена одна особина з найдрібнішими еритроцитами (17,8 мкм), яка була визначена як диплоїд. Для особини з групи ІІІ з еритроцитами довжиною 27,3 мкм підтвердили припущення, що вона є триплоїдом RRL (тобто з двома геномами P. ridibundus і одним геномом P. lessonae), причому з найменшими для групи триплоїдів еритроцитами.
Порівняння морфологічних параметрів типових ди- і триплоїдних клітин (групи ІІ і ІІІ) показало, що триплоїдність призводить до значного (p<0,001) збільшення майже всіх параметрів клітини (табл. 1), за винятком двох: спостерігається незначне зменшення ядерно-цитоплазматичного відношення (p=0,16) і значне зменшення відносної поверхні клітини на 10,6% (p<0,001). Збільшення відбувається в різній мірі для різних показників. Так, збільшення великої осі клітини і ядра становить 22,9% і 18,6% відповідно, а малих осей – 9,7% і 9,4%. Це призводить до того, що триплоїдна клітина набуває більш еліптичної форми. Зміна форми еритроцита, можливо, пов’язана з адаптацією більших еритроцитів до відносно вузьких кровоносних судин (Fankhauser, 1941). Збільшення ж більшості морфологічних параметрів еритроцитів у триплоїдів має призводити до зміни інтегральної інтенсивності газообміну.
Табл. 1.
Порівняння морфологічних параметрів аномально дрібних, диплоїдних і триплоїдних еритроцитів Pelophylax esculentus (вказано середнє значення і його 95% довірчий інтервал)

Параметр

Диплоїди (D) (n=43)

Триплоїди (T) (n=12)

T/D

Особини з аномально дрібними еритроцитами (P) (n=3)

D/P

Велика вісь клітини (мкм)

23,96 (23,81–24,11)

29,45 (29,01–29,90)

1,229***

18,44 (18,02–18,87)

1,30**

Мала вісь клітини (мкм)

14,99 (13,81–16,17)

16,48 (14,65–18,31)

1,097***

11,43 (10,72–12,13)

1,31**

Площа перерізу клітини (мкм2)

282,47 (279,74–285,19)

381,68 (372,54–390,82)

1,351***

165,6 (160,3–170,9)

1,71**

Об’єм клітини (мкм3)

2841,5 (2799,5–2883,6)

4228,0 (4078,7–4377,2)

1,488***

1265,3 (1204,5–1326,2)

2,25**

Велика вісь ядра (мкм)

9,67 (9,59–9,76)

11,47 (11,31–11,63)

1,186***

7,97 (7,66–8,28)

1,21**

Мала вісь ядра (мкм)

5,65 (4,73–6,57)

6,18 (5,47–6,89)

1,094***

4,67 (4,39–4,94)

1,21**

Площа перерізу ядра (мкм2)

43,13 (42,39–43,87)

55,75 (54,28–57,22)

1,293***

29,47 (27,27–31,67)

1,47**

Об’єм ядра (мкм3)

165,73 (160,86–170,59)

232,98 (222,39–243,57)

1,406***

93,74 (83,11–104,36)

1,77**

Ядерно-цитоплазматичне відношення

0,061 (0,056–0,065)

0,056 (0,054–0,059)

0,918

0,075 (0,066–0,083)

0,81*

Відносна поверхня клітини

0,66 (0,65–0,67)

0,60 (0,59–0,61)

0,894***

0,86 (0,84–0,87)

0,77**